上海起發(fā)為System Biosciences特約經(jīng)銷商，System Biosciences,簡稱SBI，美國加州灣區(qū)新成立的生技公司，致力于*、創(chuàng)新生物技術之開發(fā)，以研發(fā)利于基因及蛋白質(zhì)功能鑒定、研究之嶄新方法和工具為宗旨。 現(xiàn)階段研發(fā)重心為RNA干擾（RNAi）研究之相關工具。 System Biosciences (SBI) 致力于開發(fā)*、革新的技術，為客戶研究蛋白組學和基因組學功能提供研究工具。SBI 是專業(yè)的慢病毒產(chǎn)品公司，提供基于慢病毒的所有相關產(chǎn)品、質(zhì)粒、試劑盒及相關配套試劑和慢病毒延伸產(chǎn)品如IPS細胞多功能性誘導試劑盒和RNAi篩選文庫。

SBI CAS720A-KIT說明書

品牌：System Biosciences

貨號：CAS720A-KIT

品名：-T7-hspCas9-H1-gRNA All-in-one Cas9 SmartNucleaseTM Plasmid & Multiplex gRNA Cloning Kit

產(chǎn)品信息

增強您的一體化Cas9 SmartNuclease質(zhì)粒與多路復用gRNA傳遞

通過將CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA一體化Cas9 SmartNuclease TM質(zhì)粒與Multiplex gRNA克隆試劑盒相結合，輕松提高功能?？傊?，這兩種產(chǎn)品可以實現(xiàn)更廣泛的需要多種gRNA的復雜基因組編輯項目。

您可以獲得CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA All-in-one Cas9 SmartNuclease質(zhì)粒的所有優(yōu)點：

• 方便地提供Cas9和gRNA與一個單一的載體
• 用CAG啟動子驅(qū)動Cas9表達，其在原代細胞和干細胞中提供高表達水平
• 從H1啟動子表達gRNA以獲得較大特異性并選擇靶標
• 確保有效利用N期和C期核定位信號（NLS）將Cas9導入細胞核
• 在C-term NLS之后通過WPRE調(diào)控元件促進Cas9基因表達并穩(wěn)定轉錄本
• 用N-term myc-tag輕松檢測和/或純化Cas9蛋白
• 使用T7啟動子通過體外轉錄產(chǎn)生Cas9 mRNA

結合Multiplex gRNA克隆試劑盒的優(yōu)點：

• 一次編輯多個基因座，節(jié)省時間和試劑
• 容易產(chǎn)生多順反子gRNA表達構建體
• 適用于Cas9切割酶應用
• 非常適合研究信號通路

正如我們所有的Cas9交付選項一樣，CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA質(zhì)粒在功能上得到了驗證，并得到了我們的專家團隊的支持 - 如果您有基因組工程問題，只需通過電子郵件tech @ systembio發(fā)送問。 com。

為什么建議使用人力資源定位向量

盡管單獨由Cas9引起的DSB可導致基因敲除，但SBI建議使用HR靶向載體（也稱為HR供體載體）以實現(xiàn)更有效和的突變。人力資源捐助者可以提供正面或負面選擇的要素，以確保更容易識別成功的突變事件。此外，HR供體可以包含高達6-8 kb的開放閱讀框用于基因敲入或標記，并且當5'或3'同源臂中包含小突變時，可以進行特定的靶向基因編輯。

使用此表格選擇適合您的CRISPR / Cas9產(chǎn)品：

使用SBI的一體化Cas9 SmartNuclease質(zhì)粒和Mulitplex gRNA克隆試劑盒

工作流程一目了然  

圖1. Multiplex gRNA克隆試劑盒工作流程。

使用Multiplex gRNA克隆試劑盒準備您的多重gRNA插入片段（圖1）

PrecisionX Multiplex gRNA克隆試劑盒提供H1和U6啟動子區(qū)域，可輕松構建多個gRNA盒（圖1）。在步驟1中，將含有所需gRNA（由用戶設計）和腳手架 - 啟動子區(qū)段（來自試劑盒）的重疊末端的引物在PCR反應中合并以產(chǎn)生含有兩種gRNA的PCR擴增子。在步驟2中，將PCR擴增子與融合反應混合物一起與用于無縫構建的線性化表達載體組合。

• 轉化到感受態(tài)細胞中并在LB /卡那霉素平板（50μg/ ml）中生長
• 通過直接測序確認陽性克隆
• 使用標準轉染方案將經(jīng)過序列驗證的一體化構建體轉染到哺乳動物細胞中（如果您的應用需要，與HR靶向載體共轉染）
• 進行Surveyor核酸酶測定（或其他適合的錯配切割測定）以檢查位點特異性基因組切割并選擇期望的克隆

用CRISPR / Cas9進行基因組工程

有關使用CRISPR / Cas9技術進行基因組工程的一般指導，請查看我們的CRISPR / Cas9教程以及以下應用筆記：

CRISPR / Cas9基因敲除應用簡報（PDF）» 
CRISPR / Cas9基因編輯應用簡報（PDF）» 
CRISPR / Cas9基因標簽應用簡報（PDF）»

CRISPR / Cas9基礎

通過仔細選擇靶序列和設計供體質(zhì)粒進行同源
重組，您可以使用CRISPR / Cas9實現(xiàn)且高度靶向的基因組修飾。

系統(tǒng)

Cas9蛋白質(zhì) - 指導RNA（gRNA）指導位點特異性雙鏈DNA切割，與目標DNA中的原型銜接子基序（PAM）相鄰。

引導Cas9切割靶基因組中的同源區(qū)域的gRNA- RNA序列。僅當gRNA同源性與PAM相鄰時才有效切割。

PAM- prototospacer銜接子基序NGG是目標DNA序列，如果指向gRNA，spCas9將從上游切除。

工作流程一目了然

設計：選擇gRNA和HR供體質(zhì)粒。選擇gRNA位點并設計供
體質(zhì)粒決定同源重組事件是否導致敲除，
敲入，編輯或標記。

構建：將gRNA克隆到一體化Cas9載體中。將5'和3'同源臂克隆到HR 
供體質(zhì)粒中。如果創(chuàng)建基因敲入，將所需基因克隆到HR供體中。

共轉染或CO-INJECT：介紹Cas9，gRNA和HR捐贈者進入靶細胞
使用共轉染質(zhì)粒，共轉導為慢病毒，或共注射的mRNA。

選擇/屏幕：選擇或篩選突變體并驗證。

VALIDATE：基因型或序列推定的突變體，以驗證單個或雙等位基因轉化。

在多個基因組位置同時進行編輯

請注意，本研究使用略有不同的All-in-One Cas9 SmartNuclease質(zhì)粒設計，但預期結果相似。

圖2. Multiplex gRNA克隆試劑盒可以有效地提供四種gRNA。 （A）我們使用了使用Multilplex gRNA克隆試劑盒和All-in-one Cas9 SmartNickase載體創(chuàng)建的四重gRNA，以從具有穩(wěn)定整合的CMV的細胞系中去除（B） 1260bp的GFP-T2A-RFP區(qū)段-GFP-T2A-RFP表達盒。我們將這四種gRNA克隆到Cas9 SmartNickase載體（EF1Nickase-H1-gRNA）中以指導兩個雙切口事件 - 一個在GFP的5'末端，另一個在RFP基因的3'末端。（C）使用僅在GFP和RFP基因外部的引物進行的PCR測定在不存在SmartNickase載體（泳道1）的情況下產(chǎn)生1600bp片段，并且在存在Cas9SmartNickase-4gRNA構建體（泳道2）的情況下產(chǎn)生340bp片段，證明SmartNickase介導的配對雙切口和GFP-T2A-RFP基因組缺失的效率。（D） GFP和RFP活性的缺失也可以在功能測定中看到，通過降低GFP和RFP熒光。

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